1.2抑制炎症小体活化
网络药理学及分子对接实验表明芳烃受体（aryl hydrocarbon receptor ，AHR ）是青黛主要成分靛蓝、靛玉红、色胺酮的作用靶点 ［ 17 ］，而有研究表明激活AHR 可通过抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 （nucleotide-binding domain-likereceptor family pyrin domain containing 3 ，NLRP3 ）转录，负向调节NLRP3 炎性小体的活化 ［ 18 ］。NLRP3 炎症小体由NLRP3 、凋亡相关微粒蛋白和半胱氨酸蛋白酶-1 组成，可导致前体IL-1β 和IL-18 分别转化为活性形式并诱导细胞死亡，靶向NLRP3 炎症小体的抑制剂WT161 已被证明可以缓解炎症性肠病 ［ 19 ］。
在1 项体外细胞实验中，青黛被证明通过激活AHR/ 细胞色素P450 （cytochrome P450 ，CYP450 ）亚酶CYP1A1 信号途径及抑制NLRP3 炎症小体活化以减轻炎症，以10 μg·mL -1 脂多糖诱导LoVo 细胞24 h 建立肠上皮细胞炎症模型，分别以0.5 mg·mL -1 青黛及1 mg·mL -1 柳氮磺胺吡啶进行干预24 、48 h ，与模型组相比，青黛干预后细胞上清液中炎症因子IL-1β 、IL-6 、IL-18 含量明显降低，IL-10 、IL-22 含量明显升高，同时可明显下调NLRP3 和半胱氨酸蛋白酶-1 的蛋白和mRNA 表达，又明显上调AHR 、CYP1A1 蛋白及mRNA 的表达 ［ 20 ］。
1.3抑制中性粒细胞迁移和浸润
中性粒细胞在先天免疫中发挥重要作用，是构成人体抵御病原体的第一道防线。但在机体非平衡状态下，中性粒细胞浸润及随后的活化会促进组织损伤，参与炎症和自身免疫性疾病。在UC 疾病过程中，中性粒细胞弹性蛋白酶和髓过氧化物酶（myeloperoxidase ，MPO ）能够促进中性粒细胞外陷阱的形成，维持和增强炎症损伤 ［ 21 ］。在UC 患者的结肠活检样本中也发现结肠黏膜中性粒细胞数量的增加与不良预后有关 ［ 22 ］。青黛在UC 中的抗炎机制与减少中性粒细胞向肠固有层的迁移和浸润，从而降低炎性因子表达有关。
动物在体实验研究表明，在3.5%DSS 诱导的大鼠结肠炎模型中，将青黛颗粒以生理盐水制成混悬液，以4.2 、8.4 、16.8 g·kg -1 ig 给药7 d ，并以5- 氨基水杨酸作为阳性对照药，结果显示青黛能降低结肠组织中炎症因子IL-1α 、IL-1β 和IL-18 的表达，并降低MPO 的活性，而MPO 活性可以用来评估结肠组织中中性粒细胞的浸润 ［ 23 ］。
此外，在DSS 诱导小鼠UC 急性模型中，将青黛溶于羧甲基纤维素钠，以455 mg·kg -1 的剂量ig 给药7 d ，并以美沙拉嗪作为阳性对照药。结果与模型组比较，青黛可显著降低肠固有层中性粒细胞比例，升高肠系膜淋巴结中中性粒细胞比例，并降低结肠组织中TNF-α 、IL-6 及MPO 含量 ［ 24 ］。
2促进肠黏膜愈合
肠上皮细胞层、黏液层、肠道菌群和免疫细胞共同构成了肠黏膜屏障，能使宿主免于病原感染和炎症刺激物持续暴露。UC 患者的肠道在慢性炎症刺激下，肠黏膜发生充血水肿和溃疡糜烂。在2015 年进行的1 项单中心、开放标签的前瞻试验中，20 例中度UC 患者每天口服2 g 青黛胶囊进行为期8 周的临床疗效和安全性研究（硫嘌呤使用已经超过12 周，并且剂量已稳定4 周以上，则允许被使用）。内窥镜检查及粪便隐血实验结果表明口服青黛胶囊可以提高中度UC 的缓解率，促进黏膜愈合，改善大便潜血 ［ 25 ］。
1 项多中心双盲临床试验显示，86 名活动期UC 患者每天给予0.5 、1.0 、2.0 g 青黛胶囊或安慰剂进行为期8 周的治疗（其中12 名患者在入院时接受了糖皮质激素治疗），与安慰剂组比较，3 个青黛治疗组均有疗效，临床缓解和黏膜愈合的患者比例均显著上升 ［ 26 ］。动物实验对青黛促进肠黏膜愈合的机制进行探索，表明紧密连接蛋白、转化生长因子-β （transforminggrowth factor-β ，TGF-β ）/Smad 和AHR/IL-22 通路可能参与该过程。
2.1增加紧密连接蛋白的表达
在1.2%DSS 诱导的小鼠结肠炎模型中，将青黛粉末混悬于水中，以120 mg·kg -1 ig 给药10 d ，通过检测上皮屏障相关分子的表达，发现与模型组比较青黛对于紧密连接蛋白（Claudin ）-1 、黏蛋白（Mucin ）-1 和Mucin-13 的表达没有显著差异 ［ 27 ］。
然而有研究表明，在3.5%DSS 诱导的大鼠结肠炎模型中，将青黛颗粒混悬于生理盐水，以4.2 、8.4 、16.8 g·kg -1 青黛ig 给药7 d ，并以5- 氨基水杨酸作为阳性对照药，可以增加结肠炎模型大鼠结肠黏膜中的闭合蛋白（Occludin ）的含量，促进血清和结肠中血管内皮生长因子和血清中内皮生长因子的表达，修复结肠黏膜损伤，但其机制尚不明确 ［ 23 ］。
2.2激活TGF-β/Smad信号通路
TGF-β 是多效性细胞因子，TGF-β/Smad 信号通路调节黏膜免疫反应，促进组织修复，是治疗UC 的关键靶标 ［ 28 ］。苑致维等 ［ 29 ］进行的动物在体实验表明，青黛可能通过TGF-β/Smad 信号通路抑制炎症反应，促进黏膜修复。该实验以5%DSS 给药7 d 建立UC 大鼠模型，青黛组和美沙拉嗪阳性对照药组每天分别以0.27 g·kg -1 青黛混悬液或0.1 g·kg -1 美沙拉嗪液溶液连续灌肠7 d 。与模型组比较，青黛组和美沙拉嗪组疾病活动指数降低，结肠组织损伤明显改善，腺体排列较整齐，炎性细胞浸润明显减少；青黛组大鼠结肠组织TGF-β 、Smad 2 、Smad 3 、p-Smad 2/3 蛋白表达升高，TGF-β 、Smad 3 mRNA 表达升高。
2.3激活AHR/IL-22信号通路
IL-22 在炎症性肠病中能够刺激抗菌肽和黏蛋白的表达，促进上皮细胞再生，增强黏膜屏障完整性。动物在体实验研究表明，青黛促进肠黏膜愈合的作用与激活AHR/IL-22 通路密切相关 ［ 27 ］。在1.2%DSS 诱导的小鼠结肠炎模型中，将青黛混悬于水溶液，以120 mg·kg -1 ig 给药10 d ，能够增加产生IL-10 的CD4 + T 细胞和产生IL-22 的CD3 -RORγt + 细胞，从而上调肠固有层单个核细胞中IL-10 、IL-22 的mRNA 水平；而在肠系膜淋巴结和脾脏中IL-10 、IL-22 和CYP1A1 的mRNA 表达水平无明显差异，表明青黛被吸收后可以通过与黏膜免疫细胞直接结合而在固有层局部发挥作用，而在肠系膜淋巴结和脾脏等远处器官则不起作用。
然而，在1.2%DSS 诱导的AHR 缺陷小鼠结肠炎模型中，以高剂量青黛（600 mg·kg -1 ）和靛蓝（300 mg·kg -1 ）混悬于水溶液ig 给药7 d ，也无法改善AHR 缺陷小鼠结肠炎症状；且与野生鼠相比，青黛和靛蓝无法增加从AHR 缺陷小鼠分离的脾细胞中IL-10 、IL-22 或颗粒酶B 的表达水平，表明青黛修复肠黏膜损伤、减轻出血的机制可能与通过AHR 激活IL-22 通路有关 ［ 27 ］。
3调节免疫稳态
肠固有层淋巴细胞和上皮内淋巴细胞构成了肠黏膜的免疫屏障，而在慢性炎症情况下，这种免疫稳态也会被打破。在UC 患者中，CD3 + 树突状细胞（dendritic cells ，DC ）产生调节性T 细胞（regulatorycell ，Treg ）的能力受损，但能诱导Th1/Th2/Th17 反应 ［ 30 ］。对24 例UC 患者及17 名健康志愿者的外周血标本中CD4 + T 细胞各亚群的比例进行检测，发现病例组Treg 细胞比例低于对照组，Th2 、Th17 细胞比例高于对照组，且Treg/Th2 和Treg/Th17 均显著低于对照组 ［ 31 ］。
青黛对UC 的治疗作用与调节T 细胞各亚群的比例有关。在2%DSS 诱导的急性结肠炎小鼠中，表现出与UC 患者相似的Th1/Th17 特征的细胞因子模式，将青黛混悬于羧甲基纤维素钠溶液中，以0.5 、1 g·kg -1 ig 给药7 d ，并以0.2 g·kg -1 柳氮磺胺吡啶作为阳性对照药，检测肠系膜淋巴结Th1 和Th17 细胞相关转录因子和细胞因子时，发现DSS 可显著诱导小鼠结肠中IFN-γ 、IL-17A 和ROR-γt 的mRNA 表达，而青黛治疗能显著降低其表达 ［ 32 ］。
在4%DSS 诱导的急性结肠炎大鼠模型中，以78.75 mg·kg -1 青黛混悬水溶液或以157.5 mg·kg -1 苦参和78.75 mg·kg -1 青黛配伍后的混悬液ig 给药7 d ，并以美沙拉嗪作为阳性对照药，发现青黛或青黛与苦参配伍能够抑制Th17 细胞分化的主要调控因子IL-6 、TGF-β 、RORγt 、STAT3 水平 ［ 33 ］。同样，体外细胞实验表明，在RoRγT 诱导的Jukat T 细胞向Th17 极化过程中，200 μg·mL -1 青黛或5 mmol·L -1 色胺酮给药24 h ，能够抑制Th17 极化所需的几种细胞因子IL-17A 、IL-17F 和IL-22 mRNA 表达 ［ 34 ］。
4调节肠道菌群
在UC 患者中，随着持续的炎症和免疫紊乱，也伴随肠道菌群的失调。肠道菌群在黏膜免疫中扮演重要角色，可以作为保护性的生物屏障，抑制病原菌的过度增殖和病毒感染；通过激活肠道上皮细胞表面的微生物相关分子模式，影响下游信号转导途径。有研究表明UC 患者肠道菌群结构会发生变化，主要表现为菌群的多样性及厚壁菌门的丰度降低 ［ 35 ］。
4.1促进抗菌肽的表达
再生基因（regenerating gene ，REG ）家族蛋白参与由胃肠道和全身炎症驱动的疾病发生，已发现结肠上皮Reg3β 和Reg3γ 在DSS 诱导的结肠炎小鼠模型中过度表达 ［ 36 ］。动物在体实验已证明在1.2%DSS 诱导的小鼠结肠炎模型中，将青黛粉末混悬于水中，以120 mg·kg -1 ig 给药10 d ，能够上调小鼠结肠上皮细胞中抗菌肽Reg1 和Reg3g 的mRNA 表达水平 ［ 27 ］。
4.2调节菌群种类和丰度
青黛对肠道菌群的调节作用研究报道有限，目前只在结肠炎动物模型中有所涉及。动物在体实验表明600 mg·kg -1 青黛混悬水溶液ig 给药7 d ，能够提高4.5%DSS 诱导的大鼠肠道瘤胃球菌属-1 和丁球菌属的丰度，这两种菌属都能产生丁酸，而丁酸作为结肠上皮细胞的重要能量来源，通过诱导编码紧密连接的基因，在维持肠屏障功能方面发挥重要作用，并且能通过游离脂肪酸受体-3 和游离脂肪酸受体-2 在肠黏膜中激活抗炎信号级联和调节免疫功能 ［ 37 ］。
此外，200 mg·kg -1 青黛混悬水溶液给药7 d 对3%DSS 诱导的结肠炎小鼠的治疗作用，可能与降低螺旋杆菌的相对丰度，增加消化球菌的相对丰度密切相关。螺旋杆菌通过糖酵解产生乳酸，通常在人和动物的胃肠道和粪便中被检测到，现已证实与IL-6 、IL-1β 、TNF-α 、IFN-γ 等促炎细胞因子呈正相关。消化球菌不发生糖酵解，但能酵解蛋白质、肽和氨基酸 ［ 38 ］。
1 项动物在体研究表明，青黛、靛蓝、靛玉红都可以调节DSS 诱导的UC 小鼠肠道菌群结构，但其效果不同。在3%DSS 导致的结肠炎模型小鼠中，以200mg·kg -1 青黛、4.76 mg·kg -1 靛蓝和0.78 mg·kg -1 靛玉红的混悬水溶液分别ig 给药7 d ，并以柳氮磺吡啶作为阳性对照药，与模型组比较，青黛、靛蓝和靛玉红增可加益生菌乳酸菌的丰度，青黛和靛蓝降低条件性病原体链球菌的丰度，而青黛和靛玉红可以将有害细菌脱硫弧菌恢复到正常 ［ 14 ］。
5结语
青黛用药历史悠久，在治疗UC 时显现显著疗效。其活性成分靛蓝和靛玉红，在实验性结肠炎模型模型实验中也有改善症状作用。本文对青黛及其有效成分治疗UC 的药理作用机制进行总结，发现其作用机制比较广泛，在抗炎、促进黏膜愈合、调节肠免疫稳态以及调节肠道菌群方面发挥多重作用。在抗炎方面，青黛及其有效成分不仅能够直接抑制炎症因子的表达和炎症小体的活化，还能通过抑制中性粒细胞的募集和浸润以减轻炎症。而青黛的促黏膜愈合作用与其增加紧密连接蛋白的表达，促进TGF-β/Smad 和AHR/IL-22 信号通路密切相关。同时，青黛还能抑制Th1 和Th17 细胞从而调控T 细胞亚群的比例，维持肠免疫稳态。此外，青黛及其有效成分能促进抗菌肽的表达，增加益生菌并减少有害菌的丰度，促进损伤的修复。青黛以多种机制协同作用改善UC ，但目前各方面的机制研究数量都有限，值得深入挖掘。
靛蓝和靛玉红既是外源性又是内源性的AHR 配体 ［ 39-40 ］。AHR 广泛表达于肠道免疫和非免疫细胞，在炎症、免疫、组织修复中发挥重要作用 ［ 41-42 ］，对维持肠黏膜屏障功能和免疫稳态至关重要，是炎症性肠病治疗的潜在靶标。AHR/IL-22 信号通路已被证明参与青黛对UC 的药理作用，尤其是促黏膜愈合方方面，而AHR 与青黛其他药理作用的关联尚不清楚。除靛蓝、靛玉红外，青黛中仍含多种吲哚类化合物，具有与靛蓝、靛玉红相似的药理活性 ［ 43 ］。但目前，内源性吲哚类物质代谢对UC 的影响，以及外源性吲哚类化合物对UC 的药理作用机制都不太明确，值得深入研究。此外，青黛中各种化合物在治疗UC 时的作用是否存在差异，及其如何协同发挥疗效的，仍未被完全阐述，需进一步深入探索。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：张曦，徐小婷，MOHAMMED Ismail，肖莉，孙丽新，张陆勇．青黛及其有效成分抗溃疡性结肠炎药理作用及机制的研究进展 [J]. 药物评价研究, 2022, 45(5): 997-1002.返回搜狐，查看更多